Genetik
Methoden: Weiterführend
 – Video

Hier erfährst du, wie du den genetischen Code mithilfe der DNA Sequenzierung lesen kannst und wo die DNA Sequenzierung überall Anwendung findet. Für ein noch schnelleres Verständnis, schaue dir doch gerne unser zugehöriges Video an!

DNA Sequenzierung einfach erklärt

In der DNA (Desoxyribonukleinsäure) sind die Basen (Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin) in einem Strang angeordnet. Mithilfe der DNA Sequenzierung%Verweis kannst du die genaue Reihenfolge der Basen in einem DNA Molekül bestimmen. Die Basensequenz enthält unsere genetischen Informationen quasi in verschlüsselter Form.

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DNA Doppelstrang mit Basenpaaren

Mithilfe der Informationen gelingt es unseren Zellen  Proteine/Enzyme herzustellen (Proteinbiosynthese ). Die Proteine nehmen dann Einfluss auf dann äußeres Erscheinungsbild (Phänotyp ) oder unseren Zellstoffwechsel. 

Es existieren heutzutage zahlreiche Sequenzierungsfahren wie die klassische Sanger Sequenzierung oder die moderne Nanoporen-Sequenzierung

Die DNA Sequenzierung stellt eine wichtige Analysemethode in der Forschung und Wissenschaft dar und findet zum Beispiel in der Gentechnik zur Erkennung von Erbkrankheiten Anwendung.

Definition

DNA Sequenzierung (engl. dna sequencing) ist die Ermittlung der genauen Abfolge der Nukleotide(DNA-Bausteine) in der DNA und verhilft dadurch zur Entschlüsselung der Erbinformationen. 

DNA Sequenzierung Prinzip

Bereits 2003 wurde das menschliche Genom  (=Gesamtheit des Erbmaterials) zum ersten Mal vollständig mittels Sequenzierung entschlüsselt. Das geschah im Rahmen des sogenannten Humangenomprojekt. 

Eine Herausforderung bestand/besteht aber für die Forscher lange DNA Moleküle zu sequenzieren, was vor alle die Genome eukaryotischer Lebewesen betrifft.

Doch es gibt eine Lösung: Die DNA-Stränge großer Chromosomen werden in zahlreiche Fragmente zerlegt, analysiert und anschließend in die richtige Reihenfolge gebracht. Das Verfahren bezeichnest du auch als Schrotschuss Sequenzierung (engl. shotgun sequenzierung)

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Schrotschuss-Sequenzierung

Beachte aber: Nach jeder Sequenzierung muss immer eine sogenannte DNA Sequenzanalyse stattfinden, denn wir kennen sonst nur die Abfolge der Basen, wissen aber noch nicht wofür die Abschnitte genau dienen.  Erst dann ist der sogenannte genetische Code  vollständig entschlüsselt.  

Klassische Verfahren zur DNA Sequenzierung

Beginnen wir mit den klassischen Verfahren zur Sequenzierung, die beide unabhängig voneinander und fast zeitgleich (1975 und 1977) entwickelt wurden: die Methode von Maxam und Gilbert und die Sanger Sequenzierung

Methode von Maxam und Gilbert

Das Grundprinzip der Maxam-Gilbert-Methode ist es, eine chemische Spaltung der zu untersuchenden DNA zu veranlassen. Die Spaltung wird je nach DNA Base mithilfe von spezifischen Reagenzien veranlasst.

Das funktioniert so: In 4 verschiedenen Reaktionsansätzen werden jeweils bestimmte Basen chemisch verändert und aus dem DNA Molekül entfernt. Daraufhin kommt es zu einer Spaltung an genau den Stellen. Wir erhalten nun also in jedem Reaktionsgefäß DNA Bruchstücke mit unterschiedlicher Länge, an deren Ende immer bestimmte Basen saßen.

Die DNA Fragmente können wir dann einer sogenannten Gelelektrophorese  der Länge nach auftrennen. Wenn wir nun die jeweiligen Ansätze miteinander vergleichen, können wir die DNA Sequenz ablesen. 

Das Verfahren wird heutzutage aber kaum noch praktiziert, da hier unter anderem sehr gefährliche chemischen Stoffen zum Einsatz kommen. 

Sanger Sequenzierung

Die Sanger Sequenzierung trägt ihren Namen nach ihrem Entwickler Frederick Sanger. Du kannst sie auch als Kettenabbruchmethode oder Didesoxymethode bezeichnen. 

Das Verfahren bedient sich der Funktionsweise der Polymerase Kettenreaktion (PCR) mithilfe des Enzyms DNA Polymerase und spezieller Stopp-bausteine (Didesoxynukleotide). Ziel ist es hier auch, unterschiedlich lange DNA Bruchstücke zu generieren, die sich immer um jeweils ein Basenpaar unterscheiden. Die Fragmente werden dann ebenfalls zur Auswertung der Länge nach mittels Gelelektrophorese aufgetrennt. 

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Ablauf der Sanger Sequenzierung

Das Verfahren wurde über die Jahre hinweg stetig verbessert, weiterentwickelt und wird auch heutzutage immer noch in der Forschung eingesetzt. 

Wenn du den genauen Ablauf der Sanger Sequenzierung und den Zweck der Stoppbausteine erfahren möchtest, dann ist unser Video dazu genau das Richtige für dich.

Zum Video: Sanger Sequenzierung
Zum Video: Sanger Sequenzierung

Moderne Verfahren zur DNA Sequenzierung

Da die DNA-Sequenzierung schnell einen hohen Stellenwert in der Forschung erlangte, mussten auch schnellere und effizientere Verfahren entwickelt werden. Die sogenannten Hochdurchsatzverfahren erlauben eine Sequenzierung ganzer Genome innerhalb weniger Tage. Du kannst die Methoden auch als second generation sequencing (= Sequenzierungsmethoden der zweiten Generation) bezeichnen. 

Drei Verfahren wollen wir dir im Folgenden näher erklären: Die Pyrosequenzierung, die Halbleitersequenzierung und die Nanoporen-Sequenzierung

Pyrosequenzierung

In der Pyrosequenzierung kommt ebenso wie in der Kettenabbruchmethode das Enzym DNA Polymerase zum Einsatz. Wir „beobachten“ hier quasi die Arbeit der DNA Polymerase in Echtzeit.

Die Aufgabe der DNA Polymerase besteht darin, einen DNA Einzelstrang zu einem DNA Doppelstrang zu vervollständigen, indem sie passende (komplementäre) Nukleotide anlagert und miteinander verknüpft. In der Pyrosequenzierung wird nun nacheinander jeweils eine Base hinzugegeben. Wenn die DNA Polymerase die passende Base erfolgreich einbaut hat, wird jeweils ein Lichtsignal freigesetzt. Das Lichtsignal kann von einem Detektor aufgefangen und in eine Basensequenz umgewandelt werden. 

Die Energie für die Erzeugung des Lichtsignals stammt durch die Abspaltung von Pyrophosphat (=zwei Phosphatgruppen), was immer beim korrekten Einbauen der passenden Nukleotide freigesetzt wird. Zugegebene Enzyme – die Luziferasen – können mithilfe dieser Energie Licht erzeugen. Die Form der Lichterzeugung kannst du auch als Biolumineszenz bezeichnen.  

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Pyrosequenzierung

Das Verfahren kommt zum Beispiel zum Einsatz, wenn wir herauszufinden wollen, wie viele Genmutationen  im Erbgut vorhanden sind. 

Halbleitersequenzierung

Die Halbleitersequenzierung ähnelt dem Prinzip der Pyrosequenzierung. Allerdings messen wir hier kein Lichtsignal, sondern freigesetzte Ionen (H+). Auch in der Halbleitersequenzierung haben wir es wieder mit einer einzelsträngigen DNA zu tun, die durch die DNA Polymerase zu einem Doppelstrang vervollständigt werden soll.

Beim Einbau eines passenden Nukleotids wird jeweils ein Proton (=positiv geladenes Ion) freigesetzt. Das wird von einem sogenannten Halbleiter detektiert und an einen Rechner zur Auswertung weitergeben. Dadurch gelingt es uns,  die Basensequenz ermitteln. 

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Halbleitersequenzierung

Nanoporen-Sequenzierung

Wir können die Nanoporen-Sequenzierung eigentlich bereits zur „dritten Generation“ zählen, da wir in dem Verfahren nur einzelne DNA Moleküle untersuchen (=Einzelmolekülsequenzierung). Es ist also keine vorangestellte PCR notwendig, um genug DNA Material für die Sequenzierung herzustellen. 

In dem Verfahren passiert ein DNA-Einzelstrang eine sogenannte Nanopore. Darunter kann du einen sehr kleinen Kanal innerhalb einer Membran verstehen. In der Nanopore wird mithilfe einer elektrischen Spannung ein Ionenstrom erzeugt, der gemessen wird. Da sich die jeweiligen DNA Basen in ihrer Größe unterscheiden, blockieren sie die Nanopore auch unterschiedlich stark. Das beeinflusst wiederum den Ionenstrom, denn je nach Platzbedarf können entweder mehr oder weniger Ionen fließen. Mittels Strommessungen ergibt sich dann für jedes Nukleotid ein spezifischer Wert. So können wir die Basensequenz des DNA Moleküls herausfinden. 

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Nanoporen-Sequenzierung

DNA Sequenzierung Anwendungsbereiche

Schauen wir uns zum Schluss noch die Anwendungsbereiche der DNA Sequenzierung an.  

Ein Anwendungsfeld ist die medizinische Diagnostik. So können wir im Rahmen einer genetischen Untersuchung Erbkrankheiten wie Chorea Huntington mittels DNA Sequenzierung erkennen. Das ermöglicht uns, das Risiko der Erkrankung einzuschätzen und schnellstmöglich eine passende Therapie einzuläuten. Um unser menschliches Genom routinemäßig zu sequenzieren, sind die Verfahren aber leider noch zu aufwendig bzw. zu teuer. 

Zudem kommt die DNA Sequenzierung in der Phylogenetik zum Einsatz. Das bedeutet, dass sich die Forscher mit der Abstammung von Lebewesen und deren Verwandtschaftsbeziehungen beschäftigen. Die aus der Sequenzierung gewonnenen Daten werden dann zur Erstellung von Stammbäumen verwendet. 

Wenn du wissen möchtest, wie du einen Stammbaum richtig analysierst, dann ist unser Video zur Stammbaumanalyse das Richtige für dich!

Zum Video: Stammbaumanalyse
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