Sanger Sequenzierung
Mithilfe der Sanger Sequenzierung kannst du die Abfolge der Basen innerhalb eines DNA-Moleküls feststellen. Wie das funktioniert, erklären wir dir in diesem Beitrag!
Du willst noch einfacher lernen? In unserem Video zum Thema erklären wir dir alles in nur wenigen Minuten!
Inhaltsübersicht
Sanger Sequenzierung einfach erklärt
Die Sanger Sequenzierung oder Kettenabbruchsynthese ist eine wichtige Methode in der DNA Sequenzierung. Durch sie gelingt es dir, die Abfolge der einzelnen DNA Bausteine (Nukleotide ) und dadurch die Reihenfolge der Basen (Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin) zu ermitteln. In ihnen sind nämlich unsere genetischen Informationen versteckt.
Das Grundprinzip der Sanger Sequenzierung liegt darin, mithilfe von Enzymen unterschiedlich lange DNA Abschnitte zu generieren, die sich jeweils um nur ein Basenpaar unterschieden. Anschließend können sie ihrer Länge nach analysiert werden. Über den Umweg können wir dann auf die Basenabfolge schließen.
Sequenzierungsmethoden dienen uns beispielsweise dazu, Erbkrankheiten (frühzeitig) zu erkennen oder Verwandtschaftsbeziehungen aufzuklären.
Die Sanger Sequenzierung (Kettenabbruchmethode, Didesoxymethode) dient der Ermittlung der genauen Abfolge der Nukleotide in der DNA. Sie ist eine klassische Methode in der DNA Sequenzierung.
DNA Sequenzierung Sanger
Die Sanger Sequenzierung wurde nach ihrem Entwickler Frederick Sanger benannt. Sie gilt als klassisches Verfahren in der DNA Sequenzierung und wurde stetig weiterentwickelt und verbessert. Auch heute noch kommt sie in Laboren zum Einsatz. Allerdings ist sie nicht so leistungsfähig und wird häufig durch modernere Verfahren („next generation sequencing„) abgelöst.
Eine Voraussetzung der DNA Sequenzierung nach Sanger ist es, dass uns ein kleiner Sequenzbereich des zu untersuchenden DNA-Abschnitts bekannt ist. An den Abschnitt kann dann ein passender künstlich hergestellter Starter (Primer) „andocken“, damit das zum Einsatz kommende Enzym DNA Polymerase seine Arbeit beginnen kann. Die besteht darin, passende DNA-Bausteine an den Vorlagestrang zu lagern und miteinander zu verknüpfen. Hier macht man sich die Funktionsweise der Polymerase Kettenreaktion (PCR) zu Nutze.
Wenn du wissen möchtest, wie eine Polymerase Kettenreaktion genau funktioniert und wo sie sonst noch angewendet wird, dann schau dir unbedingt unser Video dazu an!
Denaturierung
Zunächst erfolgt unter Hitzeeinwirkung (circa 90 Grad) eine Denaturierung der doppelsträngigen DNA, deren Basenabfolge wir herausfinden wollen. Wir erhalten nun jeweils zwei Einzelstränge. Einer der beiden Stränge dient uns als Vorlage (Matrize) für die Sequenzierung, mit dem wir jetzt weiter fortfahren.
Primeranlagerung (Primerhybridisierung)
Im nächsten Schritt – der Primerhybridisierung– lagert sich jeweils ein aus wenigen Nukleotiden bestehender Starter (Primer) an den passenden (komplementären) Abschnitt auf dem DNA Vorlagestrang an.
Herstellung der Reaktionsansätze
Daraufhin stellen wir 4 parallele, grundsätzlich identische Reaktionsansätze her, die aus folgenden Zutaten bestehen:
- den zu untersuchenden DNA Einzelstrangabschnitten (Matrize) mit angelagerten Primern
- DNA Bausteine (Nukleotide) mit den 4 DNA Basen
- das Enzym DNA Polymerase
Zusätzlich enthält jeder Ansatz jeweils spezielle Stopp-Nukleotide (Didesoxynukleotide). Sie besitzen die besondere Eigenschaft, dass sie sich nur an einer Seite mit einem weiteren Nukleotid verbinden können. Konkret bedeutet das, dass beim Einfügen eines der Stoppbausteine die DNA Synthese zum erliegen kommt. Aus dem Grund bezeichnest du die Sanger Sequenzierung auch als Kettenabbruchmethode.
Beachte hierbei: Jeder Ansatz enthält nur eine Sorte der Stopp-Nukleotide (einer mit einem Adenin-Stoppbaustein, der Nächste mit Thymin, ein Weiterer mit Guanin und der Letzte mit Cytosin)
Polymerisation
Jetzt kann die DNA Polymerase mit ihrer Arbeit beginnen und vom Primer ausgehend neue, passende DNA Bausteine anlagern und miteinander verknüpfen (=Polymerisation ).
Das kommt dir wahrscheinlich noch aus der DNA Replikation in unseren Zellen oder in der Polymerase Kettenreaktion (PCR) bekannt vor.
Die Polymerisation findet nun so lange statt, bis die DNA Polymerase ein Stopp-Nukleotid anlagert. In dem Fall kommt die DNA Synthese zum erliegen. Wichtig: Der Kettenabbruch geschieht rein zufällig.
Untere Reaktionsgefäße enthalten dann nach einiger Zeit unterschiedlich lange DNA Fragmente, die jeweils immer mit dem gleichen Stopp-Nukleotid (je nach Ansatz Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin) enden. Es kommt also immer an der selben Base zum Kettenabbruch, aber an einer unterschiedlichen Stelle. Ziel ist es, alle theoretisch möglichen Sequenzfragmente herzustellen.
Auswertung
Weiter geht es mit der Auswertung unserer unterschiedlich langen DNA Fragmente:
Mithilfe einer sogenannten Gelelektrophorese gelingt es, sie so nach der jeweiligen Länge aufzutrennen, dass sie sich nur um ein Basenpaar unterschieden.
Durch das Anlegen einer elektrischer Spannung wandern die kürzeren, leichteren Fragmente der negativ geladenen DNA schneller zum Plus Pol als die längeren, schweren DNA Bruchstücke.
Wenn wir nun auf dem Gel von unten nach oben die jeweiligen Stopp-Nukleotide ablesen, erhalten wir die Basenabfolge. Deren komplementäre Sequenz entspricht dann unserer DNA Vorlage vom Anfang.
Mittlerweile werden die Stopp-Bausteine übrigens mit Fluoreszenz farbstoffen gekoppelt – natürlich je nach Base zur Unterscheidung mit einer anderen Farbe. Das hat den Vorteil, dass wir nur noch ein Reaktionsgefäß benötigen. Die Farben können wir dann nach einer Anregung durch einen Laser beobachten und so auf die jeweiligen Basen schließen.
Beachte aber: Nach jeder Sequenzierung muss immer eine DNA Sequenzanalyse stattfinden, denn wir kennen nur die Abfolge der Basen, wissen aber noch nicht wofür die Abschnitte genau dienen. Erst dann ist der sogenannte genetische Code geknackt.
Du willst noch weitere Verfahren in der DNA Sequenzierung kennen lernen und mehr über ihre Anwendungsbereiche erfahren? Dann dann schaue dir gerne unseren Beitrag dazu an!
