Cytologie

Gramfärbung

Die Gramfärbung ist eine Methode zur Analyse von Bakterien. In diesem Beitrag zeigen wir dir, wie ihr Ablauf aussieht und was sie aussagt.

%Du willst den Inhalt dieses Beitrags schneller verstehen? Dann schau dir gerne unser Video zur Gramfärbung an.

Inhaltsübersicht

Gramfärbung einfach erklärt

Mit der Gramfärbung (auch Gram-Färbung) kannst du Bakterien nach der Zusammensetzung ihrer Zellwand in zwei Gruppen einteilen. Hierbei färbst du die zu untersuchenden Bakterien mit einem Farbstoff (Kristallviolett) ein.

Je nachdem, ob sich der Farbstoff in Ethanol löst oder nicht, kannst du in gramnegative (Zellwand mit dünner Murein schicht) und grampositive (Zellwand mit dicker Mureinschicht) Bakterien unterscheiden.

Definition

Die Gramfärbung (eng. gram staining/gram stain) ist eine vom Bakteriologen Hans Christian Gram entwickelte analytische Methode. Mit ihr lässt sich die Zusammensetzung der Bakterienzellwand und somit die Unterscheidung von Bakterien in zwei große Gruppen vornehmen.

Gramfärbung Ablauf

Bevor die Gramfärbung losgeht, brauchst du ein Präparat mit den zu untersuchenden Bakterien. Diese sogenannten Grampräparate kannst du auf unterschiedlichen Arten anlegen. Entweder du hast ein Originalmaterial wie zum Beispiel Abstriche oder Körperflüssigkeiten oder du hast schon eine Probe gezüchtet. Letzteres können Bakterienkolonien sein.

Danach kann die Gramfärbung, die grundsätzlich aus vier Schritten besteht, starten:

  1. Färben: Zum Färben der Bakterien benötigst du einen basischen Farbstoff. Meistens wird die Farbe Kristallviolett/Gentianaviolett verwendet. Du gibst sie zusammen mit der organischen Verbindung Phenol auf das Grampräparat. Dabei färben sich alle Bakterien.
  2. Komplexierung: Im nächsten Schritt gibst du eine Lösung aus Iod und Kaliumiodid (Lugolsche Lösung) auf das Grampräparat. Diese Lösung sorgt dafür, dass sich größere Farbkomplexe bilden und die Farbe in den Zellen „gefangen“ ist.
  3. Entfärben: In diesem Schritt spülst du das Grampräparat mit 96%igem Ethanol ab. Dabei wird dir auffallen, dass einige Bakterien ihre Farbe abgeben (gramnegative Bakterien) und einige Bakterien ihre Farbe behalten (grampositive Bakterien).
  4. Gegenfärben: Zum Schluss behandelst du das Präparat mit dem rotblauen Farbstoff Fuchsin oder dem roten Farbstoff Safranin/Safraninlösung. Jetzt färben sich alle Bakterien, die ihre Farbe beim Entfärben abgegeben haben (gramnegative Bakterien) rot.

%Beschreibung: Ablauf einer Gramfärbung, </span><span style="color: #ff00ff;">alt text: Gramfärbung, Gram Färbung, Ablauf, Gramfärbung Ablauf, grampositiv, gramnegativ, </span><span style="color: #ff00ff;">Kommentar: Bitte die Überschriften aus dem Text oben für die Einzelschritte wählen. Statt darunter zu erklären, was gemacht wird, bitte die einzelnen bestandteile markieren. Bei Schritt 1: Kristallviolett (in Pipette) und Bakterienkolonie (auf Präparat) markieren, außerdem auch die stäbchen und punktförmigen Bakterien miteinbeziehen, bei schritt 2: Lugolsche Lösung in Pipette, bei schritt 3: Ethanol in Pipette markieren, die stäbchenförmigen Bakterien entfärben, bei 4. : Fuchsin/Safranin in Pipette markieren und stäbchenförmige Bakterien rot machen 

Nach Beendigung der Gramfärbung kannst du die grampositiven Bakterien in violett und die gramnegativen Bakterien in rot erkennen.

Schritt Reagenz Farbe der Bakterienzelle
Grampositiv Gramnegativ
Färben Kristallviolett violett violett
Komplexierung Lugolsche Lösung violett violett
Entfärben Ethanol violett farblos
Gegenfärben Safranin/Fuchsin violett rot

Gramfärbung Ergebnis

Je nachdem, in welcher Farbe die Bakterien am Ende vorliegen („Gramverhalten“), kannst du sie grundsätzlich in zwei Gruppen einteilen, grampositiv und gramnegativ. Daneben kann es aber auch Bakterien geben, die eine eigene Bauweise ihrer Zellwand besitzen und sich, obwohl sie grampositiv/gramnegativ wären, anders färben. Diese Bakterien kannst du als „gramlabil“ oder auch „gramvariabel“ bezeichnen.

Dabei spielt die Dicke der Murein schicht eine große Rolle. Murein ist ein Makromolekül aus Zuckern und Aminosäuren und befindet sich in den Zellwänden von Bakterien. Archaeen enthalten kein Murein.

Grampositive Bakterien

Bei grampositiven Bakterien%Verweis? bleibt die violette Färbung nach der gesamten Behandlung erhalten.
Sie haben mit ca. 20-80 nm eine dickere Mureinschicht. Sie kann bis zu 50% der Trockenmasse der Bakterien ausmachen.

Durch diese dickere Schicht kann sich der Farbstoff nicht ins Zelläußere bewegen und sich so auch nicht in Ethanol auflösen.

%<img class="n3VNCb" src="https://www.pharmawiki.ch/wiki/media/Gramfaerbung_1.png" alt="PharmaWiki - Gramfärbung: Unterschiede zwischen gram-positiven und gram-negativen  Bakterien" width="337" height="185" data-noaft="1" />

%Beschreibung: Grampositives Bakterium, </span><span style="color: #ff00ff;">Alt text: Murein, Peptidoglycan, grampositiv, gramfärbung, Bakterium, Grampositives Bakterium, Gramfärbung;</span><span style="color: #ff00ff;">Kommentar: Genau dasselbe bild wie bei Murein und den grampositiven Bakterien nehmen

Beispiele für grampositive Bakterien sind die Actinobakterien und Firmicutes-Bakterien.

Gramnegative Bakterien

Bei gramnegativen Bakterien%Verweis? bleibt die Färbung nach der Behandlung mit Ethanol nicht erhalten. Du kannst sie anschließend mit Fuchsin/Safranin rot einfärben.
Gramnegative Bakterien haben eine etwas dünnere Mureinschicht von unter 10 nm. Hier macht sie in etwa nur 5-10% der Bakterien-Trockenmasse aus.

Der Farbstoff kann sich durch diese dünnere Schicht ins Zelläußere bewegen und wird vom Ethanol ausgewaschen.

%Hier das gleiche Bild wie bei murein mit Gramnegativem Bakterium nehmen

Gramnegative Bakterien sind beispielsweise die Cyanobakterien oder die Proteobakterien.

Weitere Methoden zur Zellwanduntersuchung

Neben der Gramfärbung kannst du auch noch weitere Methoden wählen, um die Merkmale der Bakterienzellwand zu untersuchen.

Eine Methode ist der KOH Test. Bei diesem behandelst du die Bakterien mit einem Tropfen 3%iger Kaliumhydroxid-Lösung (KOH).

Die Zellwand der gramnegativen Bakterien kann durch diese Lösung aufgelöst/lysiert werden. Die Zellen brechen auf und die DNA wird freigesetzt. Wenn du nun eine Nadel durch die Lösung ziehst, bildet sich um sie ein kleiner Faden aus DNA.

Für grampositive Bakterien ist die KOH-Lösung zu schwach, um deren Zellwand aufzulösen. Hier setzt sich somit auch keine DNA frei und du wirst auch keine Fadenbildung an der Nadel beobachten können.

%<img class="n3VNCb" src="https://www.vetbact.org/images/terms/large/DSC_2341-70-84-444_H800.jpg" alt="VetBact" width="209" height="209" data-noaft="1" />
%Beschreibung: KOH Test; </span><span style="color: #ff00ff;">Alt text: Gramfärbung, KOH Test, KOH, grampositiv, gramnegativ; </span><span style="color: #ff00ff;">Kommentar: Hier bitte immer eine Nadel verwenden: Auf der Linken seite den Test von gramnegativen Bakterien (beschriften) darstellen (Hier Bild C) und auf der Rechten seite von grampositiven Bakterien (beschriften) (Hier Bild D)

Ein weiterer Test zur Zellwanduntersuchung von Bakterien ist der Aminopeptidasetest. Bei diesem kannst du gramnegative Bakterien erkennen, indem du ein für sie spezifisches Enzym (L-Alanin-Aminopeptidase) nachweist.

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