Genetik
Methoden: Grundlagen
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Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) ist eine Labormethode, um gewünschte DNA -Abschnitte zu vervielfältigen. Hier erklären wir dir ihren genauen Ablauf, verschiedene Varianten und Anwendungsbereiche. Du willst das Thema noch schneller verstehen? Kein Problem, schaue dir gerne unser anschauliches Video dazu an!

Polymerase Kettenreaktion (PCR) einfach erklärt

Doch wozu benötigen wir eigentlich so viele DNA-(Desoxyribonukleinsäure) Abschnitte? Ganz einfach, denn oft ist nicht genügend DNA Material vorhanden, mit dem Forscher zum Beispiel in der Kriminalistik oder Medizin weiter arbeiten können. Da kommt dann die Polymerase Kettenreaktion oder kurz PCR (polymerase chain reaction) ins Spiel. 

Der Mechanismus der Polymerase Kettenreaktion ähnelt der natürlichen DNA Verdopplung (DNA Replikation ) in deinem Körper. Bei beiden Verfahren ist ein bestimmtes Enzym beteiligt: die DNA Polymerase . Sie sorgt für das „Aufbauen“ der DNA Stränge , indem sie DNA Bausteine (Nukleotide ) wie Legosteine aneinanderlagert und miteinander verbindet.  

Der Begriff Kettenreaktion bedeutet, dass Produkte eines Reaktionsablaufs für nachfolgende Abläufe verwendet werden. Jeder Reaktionsablauf (Zyklus) beinhaltet dabei immer drei Reaktionsschritte (Denaturierung, Primerhybridisierung und Amplifikation). Um eine gewünschte DNA Menge zu erhalten, müssen wir aber mindestens 20 dieser Zyklen durchlaufen. 

PCR Definition

Die Polymerase Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) ist eine enzymatische Technik, die zur schnellen Herstellung von DNA Kopien eines gewünschten DNA Abschnitts dient. PCR Schritte: Denaturierung, Primerhybridisierung und Amplifikation.

Polymerase Kettenreaktion Überblick

Die Polymerase Kettenreaktion beruht auf dem Mechanismus der zellulären DNA Replikation. Im Gegensatz zu dieser natürlichen DNA Vervielfältigung können hier aber nur relativ kurze Abschnitte kopiert werden. 

Mithilfe der PCR Methode kannst du künstlich (in vitro) einen genau definierten Abschnitt der DNA automatisch vervielfältigen. Du kannst die Polymerase Kettenreaktion auch als DNA Amplifizierung (lat. amplificare = „vergrößern“, „steigern“) bezeichnen. 

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Exponentielle Vervielfältigung der DNA

Um die PCR Methode starten zu können, benötigen wir folgende Zutaten

  • eine bekannte doppelsträngige DNA-Vorlage (engl. template dna)
  • zwei kurze, künstlich hergestellte Primer (=Startersequenzen bestehend aus 15-30 DNA Basen), die passend (komplementär) an die Enden der zu vervielfältigenden DNA paaren können
  • viele freie DNA Bausteine (Nukleotide) mit den 4 DNA Basen%Verweis (Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin) 
  • hitzestabile DNA Polymerasen (aus thermophilen Bakterien oder Archaeen z.B. Taq Polymerase)
  • eine Pufferlösung, die der DNA Polymerase eine geeignete Umgebung zum Arbeiten verschafft
  • ein Gerät, das die für die jeweiligen Schritte benötigten Temperaturen einstellt (Thermocycler)
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Benötigte Materialien für die PCR

PCR Ablauf

Schauen wir uns nun den PCR Ablauf etwas genauer an. Es handelt sich hierbei um einen zyklischen Prozess, bei dem 3 Reaktionsschritte circa 20-50 mal wiederholt werden: Denaturierung, Primerhybridisierung und Amplifikation

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Ablauf der Polymerasekettenreaktion

Schritt 1: Denaturierung

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Denaturierung

Beginnen wir mit dem ersten Schritt – der Denaturierung. Hier wird zunächst das Reaktionsgefäß mit den oben beschrieben Zutaten im Thermocycler auf circa 90 Grad Celsius erhitzt. Die hohen Temperaturen sorgen dafür, dass sich die  Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den DNA Doppelsträngen trennen. Das bezeichnest du als Denaturierung. Wir erhalten nun aus einem DNA Doppelstrang zwei DNA Einzelstränge, die als Vorlage für ihre Vervielfältigung dienen. 

Schritt 2: Primerhybridisierung

Im zweiten Schritt – der sogenannten Primerhybridisierung – muss das Reaktionsgemisch auf circa 50-65 Grad (je nach Länge des Primers) abgekühlt werden. Jetzt können die Primer (Startmoleküle) an die jeweiligen Vorlagestränge binden (= engl. primer annealing).

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Primerhybridisierung

Hier gilt das Prinzip der komplementären Basenpaarung (Adenin mit Thymin und Guanin mit Cytosin): Die Primer passen genau an die Enden (3′ ) der einzelsträngigen Matrizen. Da wir zwei unterschiedliche Primer hinzugeben, können wir Anfang und Ende der gewünschten Sequenz genau festlegen. 

Schritt 3: Amplifikation

Im dritten Reaktionsschritt – Amplifikation, Elongation oder Polymerisation genannt- erfolgt eine erneute Erhöhung der Temperatur. Das ist notwendig, um die optimale Arbeitstemperatur des Enzyms DNA Polymerase (circa 70 Grad Celsius) zu erreichen. Sie benötigt die zuvor eingesetzten PCR Primer als Starter, um ihre Arbeit zu beginnen. 

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Amplifikation

Diese besteht darin, am 3′-Ende der Primer die passenden, zugegeben Nukleotidbausteine anzulagern und zu verknüpfen. So erhalten wir eine zum Vorlagestrang komplementäre DNA Sequenz. 

Am Ende der Elongationsphase können wir nun wieder mit Schritt 1 – der Denaturierung – starten, um die beiden enthaltenen Doppelstränge zu trennen und eine erneute Vervielfältigung zu ermöglichen. 

Ein Zyklus dauert nur wenige Minuten, um zwei identische Kopien der Ziel DNA zu erhalten. Wenn wir diesen Zyklus nun viele Male wiederholen, steigt auch die Anzahl der Kopien exponentiell (1-2-4-8-16 usw.) an. 

Identifikation der PCR Produkte

Am Ende aller PCR Zyklen erfolgt dann meist eine Trennung und Identifikation der erhaltenen DNA Fragmente anhand ihrer Länge. Denn das Ziel der PCR ist es, wie du bereits weißts, eine ganz bestimmte DNA Sequenz zu vervielfältigen. In der Laborpraxis entstehen aber durchaus verschiedene Fragmente unterschiedlicher Länge, weswegen eine Trennung erforderlich ist. 

Hierfür bedienen sich Forscher häufig der sogenannten Agarose Gelelektrophorese . Darunter kannst du verstehen, dass die DNA Abschnitte auf einem Agarose-(Zucker ) Gel platziert und mittels elektrischer Spannung aufgetrennt werden. Die kürzeren Abschnitte „wandern“ schneller zum Pluspol als die Längeren.

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Agarose Gelelektrophorese

PCR Varianten

Das ursprüngliche PCR-Verfahren wurde stetig weiterentwickelt, woraus zahlreiche Varianten (Multiplex PCR, qPCR, RT-PCR, nested PCR …) entstanden sind. Drei Wichtige wollen wir dir hier kurz näher erläutern: 

qPCR (quantitative Polymerase Kettenreaktion)

Die sogenannte quantitative Echtzeit PCR oder real time PCR kannst du verwenden, wenn du herausfinden willst, wie viel DNA Abschnitte produziert wurden (=Quantifizierung). Das funktioniert über eine Zugabe von Fluoreszenzfarbstoffen. In jeden Zyklus kann dann über eine Messung der Fluoreszenz quasi in „Echtzeit“ die Menge der DNA ermittelt werden und nicht erst am Ende aller Zyklen über eine Gelelektrophorese.

Rt-PCR (Reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion)

Die RT-PCR (Reverse-Transkriptase-PCR) dient zum RNA (Ribonukleinsäure) Nachweis, indem man sich das Enzym Reverse Transkriptase zur Nutze macht. Sie ist in der Lage aus einem RNA Abschnitt eine cDNA (complementary DNA) herzustellen, die dann über eine Polymerase Kettenreaktion vermehrt werden kann.  Der „Umweg“ ist notwendig, weil die DNA Polymerasen keine RNA vervielfältigen können. 

Die Methode dient zum Beispiel dazu die Erbinformationen(=Genom ) von RNA-Viren zu ermitteln, was in der medizinischen Diagnostik von großer Bedeutung ist. 

Nested PCR 

Bei der nested (verschachtelte)-PCR finden zwei PCR Reaktionen hintereinander statt, wobei das gewünschte PCR Produkt eines ersten Reaktionsansatz als Vorlage für eine zweite Reaktion mit anderen Primern dient. 

Sie bietet sich an, wenn nur wenig gewünschte DNA Probe im Vergleich zur Gesamtprobenmenge zur Verfügung steht. Das ist zum Beispiel in der Forensik der Fall, wenn geringe Mengen brauchbarer Spuren (z.B. Blut, Haare) zur Täterüberführung vorhanden sind.

PCR Anwendung

Die PCR Methode findet in zahlreichen Bereichen in Forschung und Wissenschaft Anwendung. 

Ein Gebiet hast du ja bereits kennengelernt: die Kriminalistik. Dort dient sie als Hilfswerkzeug, um genug DNA Material  für die Erstellung eines genetischer Fingerabdruck herzustellen.  

Auch in der in der Medizin können bestimmte Virusinfektionen (z.B. HIV, Sars-COV-2) mittels PCR erkannt werden (= PCR Test),  indem die virale RNA oder DNA vervielfältigt wird.  

Zudem beruhen viele Methoden der DNA Sequenzierung – also der Bestimmung der Basenabfolge in der DNA – auf der Polymerase Kettenreaktion. Dadurch können beispielsweise Erbkrankheiten erkannt werden. 

Außerdem verhilft die Polymerase Kettenreaktion der Paläontologie dazu, mehr DNA Material von gefunden fossilen Lebewesen zu generieren. Daraus können dann weitere wichtige wissenschaftliche Erkenntnisse gewonnen werden. 

Ein weiterer relevanter Einsatzbereich der PCR ist beim Klonieren eines Gens  (=Abschnitt, der für ein Protein codiert). Hier wird ein Gen aus einem Organismus entnommen und in einen anderen eingefügt. Für die Vermehrung dieses Gens sorgt die Polymerasekettenreaktion. Die Klonierung kann zum Beispiel zur Herstellung von wichtigen Proteinen wie Arzneistoffen (z.B. Humaninsulin) führen. 

Zusammenfassung

  • Die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) ist eine Methode der Molekulargenetik, um künstlich gewünschte DNA Abschnitte zu vervielfältigen.
  • Der Mechanismus ähnelt der natürlichen DNA-Verdopplung (DNA Replikation ) in unseren Zellen
  • Zutaten sind die DNA-Vorlage , zwei Primer, verschiedene DNA Nukleotide, Pufferlösung und das Enzym DNA Polymerase
  • Es handelt sich um eine zyklische Abfolge von drei Reaktionsschritten (Denaturierung, Primerhybridisierung, Amplifizierung)

 

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